For accurate interpretation of quantitative real-time PCR (qPCR) data, stable reference genes are essential for normalization of target genes. To date, there is no information on reliable housekeeping genes in CD4+ T cells in a three-dimensional (3D) matrix under pressure stimulation. This in vitro study describes for the first time a method for pressure stimulation of CD4+ T cells in a 3D matrix in the context of orthodontic tooth movement (OTM) and identifies a set of reliable reference genes. CD4+ T cells were isolated from murine spleen and activated with anti-CD3/-CD28 Dynabeads (Thermo Fisher, Langenselbold, Germany) on standard cell culture plates or in 3D scaffolds with or without compressive strain. Expression stability of nine potential reference genes was examined using four mathematical algorithms. Gene expression of Il2 was normalized to all potential reference genes to highlight the importance of correct normalization. Cell proliferation and the expression of the surface markers CD25 and CD69 were also determined. The 3D matrix did not inhibit proliferation after immunological activation of T cells and embedded the cells sufficiently to expose them to pressure load. Expression of ubiquitin C (Ubc) and hypoxanthine phosphoribosyltransferase (Hprt) was the most stable under all conditions tested. A combination of these two genes was suitable for normalization of qPCR data. Normalization of Il2 gene expression showed highly variable results depending on the reference gene used. Pressure reduced cell proliferation and the number of CD69-positive T cells. This study provides a basis for performing valid and reliable qPCR experiments with CD4+ T cells cultured in 3D scaffolds and exposed to compressive forces simulating OTM.
Für eine korrekte Interpretation von quantitativen Real-time-PCR(qPCR)-Daten sind stabile Referenzgene zur Normalisierung der Zielgene unerlässlich. Bislang gibt es keine Daten zu zuverlässigen Housekeeping-Genen in CD4+ T‑Zellen in einer 3‑D-Matrix unter Druckstimulation. In dieser In-vitro-Studie werden zum ersten Mal eine Methode zur Druckstimulation von CD4+ T‑Zellen in einer 3‑D-Matrix im Rahmen der kieferorthopädischen Zahnbewegung (KZB) beschrieben und eine Reihe von zuverlässigen Referenzgenen identifiziert. CD4+ T‑Zellen wurden aus der Milz der Maus isoliert und mit Anti-CD3/-CD28-Dynabeads (Thermo Fisher, Langenselbold, Deutschland) auf Standardzellkulturplatten oder in 3‑D-Gerüsten mit oder ohne Druckbelastung aktiviert. Die Expressionsstabilität von 9 potenziellen Referenzgenen wurde mit 4 mathematischen Algorithmen untersucht. Die Genexpression von Il2 wurde auf alle potenziellen Referenzgene normalisiert, um die Bedeutung einer korrekten Normalisierung hervorzuheben. Die Zellproliferation und die Expression der Oberflächenmarker CD25 und CD69 wurden ebenfalls bestimmt. Die 3‑D-Matrix führte zu keiner Hemmung der Proliferation nach immunologischer Aktivierung der T‑Zellen und bettete die Zellen ausreichend ein, um sie einer Druckbelastung auszusetzen. Die Expression der Gene Ubiquitin C (Ubc) und Hypoxanthin Phosphoribosyltransferase (Hprt) war unter allen getesteten Bedingungen am stabilsten. Eine Kombination dieser beiden Gene war für die Normalisierung von qPCR-Daten geeignet. Eine Normalisierung der Il2-Genexpression zeigte je nach verwendetem Referenzgen sehr unterschiedliche Ergebnisse. Druck reduzierte die Zellproliferation und die Anzahl der CD69-positiven T‑Zellen. Diese Studie bietet eine Grundlage zur Durchführung valider und reliabler qPCR-Experimente mit CD4+ T‑Zellen, die in 3‑D-Gerüsten kultiviert und Druckkräften im Rahmen einer KZB ausgesetzt wurden.
Keywords: Biomechanics; Immunity; Lymphocytes; Orthodontic tooth movement; RT-qPCR.
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